Please use this identifier to cite or link to this item: http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/345630
Type: DISSERTAÇÃO DIGITAL
Degree Level: Mestrado
Title: Uso combinado de cristalografia de proteínas e espectometria de massas para a seleção antecipada de produtos naturais bioativos
Title Alternative: Combined use of protein crystallography and mass spectrometry for the early identification of bioactive natural products
Author: Ferreira, Raquel Ortega, 1994-
Advisor: Trivella, Daniela Barretto Barbosa
Abstract: Resumo: Produtos naturais são a principal fonte de novos fármacos e estes representam 75% dos fármacos atualmente disponíveis. Porém, a descoberta de fármacos a partir de fontes naturais é muito desafiadora devido à diversos fatores, como a identificação do composto de interesse nas primeiras etapas do processo e a obtenção de miligramas do produto bioativo puro, principalmente quando o composto-alvo é produzido em quantidades minoritárias pelo organismo-fonte. Com isto, nosso grupo vem trabalhando em abordagens alternativas para obtenção de duas informações essenciais na fase inicial da descoberta de PNs bioativos: estrutura química do composto natural e modo de ação da substância química no alvo. Esta estratégia se baseia na aplicação da pescaria cristalográfica e de redes moleculares, técnicas ortogonais baseadas em cristalografia de proteínas e espectrometria de massas que são conduzidas em escala miniaturizada, sendo passíveis de automação e de processamento integrado de dados. Neste trabalho, a abordagem foi aplicada para avaliar extratos de bactérias marinhas e frações cromatográficas derivadas, frente à inibição da atividade tipo quimiotripsina da partícula 20S do proteassomo ¿ alvo este validado contra câncer. Dentre os extratos bioativos, selecionamos a amostra BRA346, proveniente de uma bactéria marinha do gênero Streptomyces, para aplicar as metodologias supracitadas como prova de conceito de nossa abordagem. Com apenas 5 mg do extrato bruto, em apenas duas semanas e procedimentos miniaturizados, foi possível propor a estrutura química do composto bioativo, o inibidor TMC-86A, além do sítio e do mecanismo de interação deste com o proteassomo. Foi verificado também que esse composto era minoritário e representava apenas 0,03% do extrato bruto, sendo assim, seu isolamento era um limitante para a descoberta e caracterização do inibidor. Abordagens tradicionais de isolamento de PNs foram aplicadas para prova de conceito, obtendo-se frações purificadas do composto alvo a partir de dois novos cultivos da bactéria marinha em escala ampliada, permitindo validar o PN responsável pela atividade biológica observada. No entanto, foi observada diminuição da produção do composto-alvo e também a variação de isômeros produzidos pela bactéria nos diferentes cultivos, alguns dos principais gargalos na área de PNs. Assim, as abordagens alternativas aqui aplicadas se mostraram eficazes e essenciais para a identificação do PN bioativo e seu modo de ação. Para a conclusão deste trabalho, selecionamos um análogo do inibidor para tentar confirmar a estrutura química proposta, por RMN. Este produto natural mostrou-se 67% semelhante ao TMC-86A por meio das análises do espectro de fragmentação de massas, sendo inativo frente a inibição do proteassomo e produzido em maior quantidade pela bactéria. Ainda assim, ao final dos três ciclos de purificação, não obteve-se massa suficiente para sua elucidação estrutural por RMN, provando na prática como é desafiadora a pesquisa com PNs pela abordagem tradicional. Isto ressalta a necessidade do desenvolvimento da abordagem aqui apresentada para a identificação antecipada de novos compostos bioativos. Portanto, espera-se que as novas metodologias aqui empregadas sejam usadas rotineiramente pela comunidade científica, auxiliando a tomada de decisão no processo de descoberta de produtos naturais bioativos e auxiliando na identificação antecipada de compostos naturais de interesse farmacêutico

Abstract: Natural products are the main source of new drugs and they represent 75% of all the currently available drugs. However, the discovery of new drugs from natural sources is challenging due to several factors, such as identifying the interest compound in the first steps of the process and obtaining pure bioactive product, especially when the target compound is produced in minority quantities by the source organism. Our group has been working on alternative approaches to obtain two essential information in the initial process of bioative NP discovery: the natural compound chemical structure and its mode of action in the target protein. This strategy is based on crystallographic fisheing and molecular networking methods, orthogonal techniques based on protein crystallography and mass spectrometry, which are conducted on a miniaturized scale and are capable of automation and integrated data processing. In this work, the techniques were applied to evaluate marine bacteria extracts and derived chromatographic fractions against the inhibition of the chymotrypsin-like activity of the 20S proteasme particle ¿ a validated target against cancer. Among the bioactive extracts, we selected the sample BRA346 from a marine bacterium of the genus Streptomyces, to apply the aforementioned methodologies as proof of concept of our approach. With only 5 mg of the crude extract, in only two weeks and miniaturized procedures, it was possible to propose the chemical structure of the bioactive compound, inhibitor TMC-86A, besides its site and the mechanism of interaction with proteasome. It was also found that this compound was minor and represented only 0.03% of the crude extract; thus, its isolation was a limiting factor for the characterization of the inhibitor. Traditional NP isolation approaches were applied for proof of concept, obtaining purified fractions of the target compound from two new cultures of the marine bacterium in large scale, allowing to validate the NP responsible for the biological activity observed. However, it was observed a decrease in the target compound production and a variation of isomers produced by the bacterium in different cultures, some of the main problems related to NPs. Thus, the alternative approaches applied here proved effective and essential for the identification of bioactive NP and its mode of action. To conclude this work, we selected an inhibitor analogue to try to confirm its proposed chemical structure by NMR. This natural product was 67% similar to TMC-86A, based on their fragmentation MS spectra, being inactive against the inhibition of the proteasome and produced in greater quantity by the bacterium. Even so, at the end of three purification cycles, sufficient mass was not obtained for its structural elucidation by NMR, showing in practice how challenging is NP research by the traditional approach. As a perspective, our group is working on the automation of mass spectrometry and crystallography data processing, aiming to make feasible the use of these methodologies in the routine search of new bioactive compounds by the scientific community, assisting on decision making in the proecss of NP Discovery and helping in the early identification of natural compounds of pharmaceutical interest
Subject: Proteassomo
Cristalografia de proteínas
Produtos biológicos
Ensaios de triagem em larga escala
Descoberta de drogas
Language: Português
Editor: [s.n.]
Citation: FERREIRA, Raquel Ortega. Uso combinado de cristalografia de proteínas e espectometria de massas para a seleção antecipada de produtos naturais bioativos. 2018. 1 recurso online (120 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP.
Date Issue: 2018
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

Files in This Item:
File SizeFormat 
Ferreira_RaquelOrtega_M.pdf6.33 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.